Читаем Эпигенетика онлайн бесплатно
Дальнейшие параллели между Xi и конститутивным гетерохроматином последовали в результате использования непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии для изучения распределения модификаций и вариантов гистонов по метафазным хромосомам и в интерфазных ядрах. Факультативный гетерохроматин неактивной Х-хромосомы и в клетках человека, и в клетках мыши обеднен ацетилированным гистоном Н4 (Jeppesen and Turner, 1993) и в этом отношении напоминает конститутивный, центрический гетерохроматин. Это явилось первой демонстрацией того, что неактивная Х-хромосома маркирована модификацией гистонов специфического типа. Последующие эксперименты, проведенные в нескольких лабораториях, подтвердили эти наблюдения и показали далее, что ацетилированные изоформы всех четырех коровых гистонов (H2A, H2B, H3 и Н4) обеднены и конститутивным, и факультативным гетерохроматином в интерфазных и метафазных клетках (O’Neill et al., 2003 и помещенные там ссылки). В частности, и центрический гетерохроматин, и Xi обеднены H3, ди- и три-метилированным по К4 (H3K4me2 и H3K4me3). Обычно полагают, что эти последние, как и ацетилирование, являются маркерами транскрипционно активного (или потенциально активного) хроматина.
Ситуация становится сложнее, когда рассматривается появление меток, ассоциированных с транскрипционным сайленсингом, а не изчезновение меток, связанных с транскрипционной активностью. Например, гистоны H3, ди- и триметилированные по К9 (H3K9me2/3), — характерные метки транскрипционно «активных» генов, и с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии нередко можно видеть, что они обогащены центическим гетерохроматином (Lachner et al., 2003). Однако по ряду технических и биологических причин, обогащенность ими Xi выглядела неопределенной. По этой причине, следует подчеркнуть значение специфичности антител для получения надежных результатов иммунофлуоресценции Например, лизины 9 и 27 в H3 оба являются частью тетрапептидного ARKS, и антитела, полученные против одного, могут давать перекрестную реакцию с другим. Такие перекрестные реакции должны быть тщательно исключены, прежде чем полученные результаты можно будет надежно интерпретировать. Кроме того, использованная процедура иммунизации и использованный иммуноген могут влиять на тонкую специфичность антисывороток. Например, антисыворотки к H3K9me3, полученные с поперечносшитыми [cross-linked] пептидами, сильнее связываются с этим модифицированным гистоном, когда он находится в гетерохроматиновом районе, чем когда он в эухроматине (Maison et al., 2002). Антисыворотки, полученные таким образом, являются ценными реагентами ддя исследований по гетерохроматину, но не идеальными ддя количественных сравнений гетерохроматина и эухроматина. Наконец, было отмечено, что усиленное иммунофлуоресцентное окрашивание в интерфазе может быть просто результатом более высокой плотности нуклеосом в гетерохроматине (Perche et al., 2000).
Тщательный анализ распределения модификаций гистонов по Xi в культивируемых клетках человека позволил глубже проникнуть в сложность этой системы (Chadwick and Willard, 2004). Определенные и неперекрывающиеся районы в Xi обогащены H3K9me3 и H3K27me3. Таким образом, в отличие от утраты ацетилирования, обогащенность этими модификациями является региональным, а не общим свойством Xi. Любопытно, что районы, обогащенные H3K27me3, оказываются также обогащенными
